Личинки данио-рерио определяют степень солености воды обонятельными нейронами

Чтобы поддерживать постоянный состав жидкостей тела, рыбы должны оценивать соленость воды, в которой обитают. Однако костистые рыбы, составляющие львиную долю всех видов рыб на планете, утратили рецепторы, которые обеспечивают большинству позвоночных восприятие соленого вкуса. До недавних пор никто не знал, как костистые рыбы определяют содержание соли в воде. Новое исследование американских и европейских биологов показало, что личинки модельной костистой рыбы данио-рерио реагируют на изменение солености небольшой группой обонятельных нейронов. В каком-то смысле «соленый» для мальков данио-рерио не вкус, а запах.

Выдающийся физиолог Кнут Шмидт-Ниельсен (Knut Schmidt-Nielsen) в автобиографии The Camel’s Nose: Memoirs Of A Curious Scientist упоминает занятную историю, как его дед Олаф Людвиг Ниельсен в 1903 году запустил в изолированное озеро неподалеку от Тронхейма тысячу мальков морской камбалы. Олаф Ниельсен, инженер по профессии и биолог по зову сердца (свой склад ума он передал и сыну, и внуку), хотел понять, сможет ли рыба, привыкшая к соленой воде, хоть сколько-то прожить в воде пресной.

Идея использовать камбалу возникла не на пустом месте — Олаф Ниельсен неоднократно видел, как взрослые особи этого вида заплывают в норвежские реки. Рыбы продержались долго: даже спустя несколько лет местные жители вылавливали из озера камбал. Однако размножаться в пресной воде морские обитатели, по-видимому, не могли, поэтому полноценной популяции там не возникло. Опыт деда, отмечает Шмидт-Ниельсен, был первым известным ему экспериментом по осморегуляции — то есть исследованию того, как живые организмы подстраивают содержание солей в теле под изменение внешних условий.

Физиологические процессы у каждого вида настроены на определенную соленость жидкостей тела, которая является ничем иным, как концентрацией различных ионов, в первую очередь — натрия и хлора (их, как правило, растворено в воде больше всего). Через покровы тела, даже самые плотные, проходят заряженные частицы и вода, и они стремятся туда, где их концентрация меньше, оттуда, где их концентрация больше. Очень редко бывает так, что содержание какого-либо иона или воды за пределами организма ровно такое же, как внутри него. Поэтому все живое вынуждено непрерывно бороться с диффузией: выводить лишнее, закачивать в себя недостающее, покидать места с неоптимальной влажностью и соленостью в пользу более подходящих для жизни.

Чтобы реагировать на соленость, нужно уметь определять ее величину. Позвоночные выявляют наличие NaCl, а точнее, ионов Na⁺, в окружающей их или поступающей внутрь воде за счет особого класса белков — эпителиальных натриевых каналов ENaC. Они встроены в мембраны клеток эпителия органов, чьи стенки особенно активно регулируют состав внутренней среды организма, всасывая воду и соли, — почек, кишечника, легких. Также ENaC встречаются и в клетках эпителия языка вокруг вкусовых сосочков. Там они участвуют в восприятии соленого вкуса. У амфибий к списку органов, богатых ENaC, добавляется кожа, через которую обмен водой и ионами идет весьма интенсивно (см. S. R. Jared, J. P. Rao, 2017. Transepithelial sodium transport across frog skin).

У рыб важнейший орган осморегуляции — жабры (рис. 2). Они содержат специальные клетки для контроля солености — ионоциты (ionocyte; раньше их называли хлоридными клетками). У пресноводных видов, чьи внутренности должны быть более «солеными» по сравнению с окружающей водой, эти клетки собирают ионы Na⁺ из воды, а у морских видов, жидкости тела которых в норме более «пресные», чем внешняя среда, они выбрасывают те же ионы наружу.

Довольно хорошо известно, как рыбы регулируют содержание солей в теле, но до сих пор никто не знает, как большинство из них определяет соленость собственного окружения. У костистых (Teleostei), к которым относится 90% всех ныне живущих видов рыб, нет эпителиальных натриевых каналов: отсутствуют гены, которые кодируют составляющие этих молекул (см. таблицу 7 в статье I. Hanukoglu, A. Hanukoglu, 2016. Epithelial sodium channel (ENaC) family: Phylogeny, structure-function, tissue distribution, and associated inherited diseases). Это касается и морских, и пресноводных видов. При этом у лопастеперых (латимерий, рогозубов) и хрящевых рыб ENaC есть. То есть костистые рыбы, вероятнее всего, соответствующие гены почему-то утратили, а у их предков они были.

Непонятно даже, в какой части тела костистых рыб находятся структуры для восприятия солености внешней среды. Наземные позвоночные сталкиваются с растворами солей в основном тогда, когда пьют и едят. У них нет надобности размещать «датчики» солености где-либо еще, кроме ротовой полости (и внутренних органов). А костистые рыбы постоянно окружены такими растворами, поэтому есть вероятность, что они определяют концентрацию солей в воде какими-то структурами не в ротовой полости, а, скажем, клетками в жабрах или элементами боковой линии — органа чувств, отвечающего за восприятие движения воды и электрических сигналов.

Биологи из Гарвардского университета, Университета Сорбонны и Института нейробиологии Общества Макса Планка попробовали выяснить, как костистые рыбы определяют соленость окружающей воды. Для экспериментов они использовали данио-рерио (Danio rerio, по-английски этих рыбок обычно называют zebrafish) — хорошо изученный вид родом из рек и озер Южной Азии. Водоемы, в которых данио обитают в природе, в сухой сезон могут существенно мельчать, и тогда концентрация солей в них возрастает на порядки. Такие изменения требуют перестройки солевого обмена — либо быстрой миграции в более пресные воды, если это возможно. Значит, данио-рерио часто сталкиваются с изменениями солености и должны уметь их выявлять.

В экспериментах использовали шести-семидневных личинок данио. Они уже самостоятельно двигаются, питаются и реагируют на большинство обычных раздражителей, но, в отличие от взрослых рыб этого вида, еще прозрачны, поэтому у них можно видеть внутренние органы без вскрытия. Некоторые опыты проводили на более молодых личинках возрастом четыре-пять дней.

Сначала исследователи определяли, на какие сдвиги солености личинки реагируют изменением поведения (и реагируют ли вообще). Для этого мальков на 60 минут запускали на индивидуальные дорожки своеобразного мини-бассейна, бортики которого были покрыты агарозой. Агароза готовится разведением порошка углеводов из водорослей в горячей воде. Когда вода охлаждается до 35–40 градусов, смесь затвердевает. Порошок для одного бортика разводили в воде такого же состава, как вода из аквариумов с данио, а порошок для другого — в воде с добавлением NaCl (400 миллимолей на литр). В ходе эксперимента из «соленого» бортика в воду постепенно выходили ионы натрия и хлора, и их концентрация была тем выше, чем ближе к агарозе. Помимо экспериментальной была и контрольная группа. Этих рыб сажали в такой же бассейн, только ни один из его бортов не выделял соль.

Движения личинок данио-рерио записывали на видео, а затем анализировали, в какой части дорожки рыбы проводят больше времени. Выяснилось, что мальки почти постоянно плавают вдоль длинной оси дорожки и периодически меняют направление движения на 180°. Данио из контрольной группы разворачивались в случайные моменты времени и одинаково долго плавали по всем участкам своих дорожек. Личинки из экспериментальной группы избегали соленой воды и чаще всего разворачивались, не достигнув выделяющего NaCl бортика. Такое поведение наблюдалось и у семидневных, и у пятидневных мальков.

Но соленость воды складывается не только из содержания в ней натрия или хлора: на месте этих ионов могут быть другие. Поэтому эксперименты повторили, добавляя в агарозу другие вещества: хлорид магния (MgCl₂), хлорид калия (KCl), хлорид рубидия (RbCl), бромид натрия (NaBr), иодид натрия (NaI). Их концентрацию подбирали так, чтобы содержание ионов в воде совпадало с тем, что получалось в предыдущей серии опытов с бортиком, содержащим NaCl. Кроме того, есть вероятность, что рыбы реагируют на общее содержание частиц в воде, а не на концентрацию заряженных частиц. Чтобы проверить это предположение, провели серию опытов с маннитолом — веществом, которое растворяется в воде (и используется в медицине как осморегулятор), но не образует в ней заряженные частицы.

Личинки данио избегали любой соли, а не только хлорида натрия (рис. 3). Реакция на крупные ионы Rb⁺ и Br⁻ была выражена у них слабее, чем на более мелкие Na⁺ и Cl⁻ — возможно, потому, что такие заряженные частицы медленнее выходили из агара. Рыбы уплывали из областей с высокой концентрацией именно заряженных частиц. Их не отпугивало повышенное содержание растворенных в воде частиц как таковое.

Что заставляет данио менять направление движения в соленой воде? Чтобы выяснить это, ученые смоделировали поведение данио в двух вариантах: 1) личинка разворачивается, руководствуясь абсолютной величиной солености (ионы в воде есть / ионов нет); 2) личинка разворачивается, исходя из повышения концентрации солей: чем содержание ионов выше, тем больше вероятность, что рыба поплывет в противоположном направлении. На основании этого ученые получили распределения вероятностей нахождения данио на разных расстояниях от источника соли. Их сравнили с тем, что наблюдалось в экспериментах.

Вторая модель больше соответствовала реальной картине. Это означало, что рыбы не выбирают некую оптимальную соленость, а избегают любого ее значения, отличного от нуля. То есть если перед данио встанет выбор, находиться в деионизированной воде, лишенной и Na⁺, и Cl⁻, или в обычной пресной воде, они выберут первую. Однако для физиологии организма вода без ионов немногим лучше слишком соленой воды: какое-то количество Na⁺, Cl⁻ и прочих подобных частиц должно поступать в организм. Впрочем, в природе деионизированная вода встречается редко, так что, вероятно, данио просто не сталкиваются с такими ситуациями, и эта особенность реагирования им не мешает.

Результаты, описанные выше, ничего не говорят о том, какие структуры в теле рыбы определяют соленость. Для ответа на этот вопрос потребовалась флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения, позволяющая «подсветить» определенную плоскость, четко увидеть все, что лежит на ней, и сохранить невредимыми остальные ткани. Это позволило увидеть, как меняется активность клеток на всем протяжении головного мозга личинки данио. Стимулом к ее изменению были потоки воды разной солености, которые периодически направляли на голову рыбы (и в дополнительной серии экспериментов — на хвост). Когда нервные клетки возбуждались, в них росло содержание ионов кальция. Эти ионы связывались с флуоресцентным белком GCaMP6 (см. GCaMP), тем самым активируя его, и белок начинал светиться. Когда возбуждение клетки прекращалось, GCaMP6 в ней тоже «угасал».

На этот раз, в отличие от первой серии опытов, голову и туловище данио закрепляли в агарозе, так что двигаться свободно они не могли (на видео из дополнительных материалов к обсуждаемой статье показано, как был устроен этот эксперимент). Но пространство вокруг хвоста исследователи оставляли без агара и по движениям хвоста определяли, что бы делала свободноплавающая рыба в ответ на десятисекундное предъявление воды с концентрацией NaCl от 0 до 100 миллимоль на литр с шагом 25 мМ/литр. Резкое движение хвоста означало, что личинка пытается развернуться и уплыть от соли, и оно почти всегда имело место, когда в голову рыбы выпускали струю соленой воды. Между стимулами проходило 40 секунд, и все это время на голову личинки шел поток пресной воды. Тестирование поведения рыбы при каждой отдельно взятой концентрации NaCl длилось пять минут.

Ученые отмечали, в каких структурах головного мозга изменение интенсивности флуоресценции следует после подачи соленой воды (а не в длинных промежутках между стимулами). Такими структурами оказались компоненты обонятельной системы: обонятельный эпителий (см. Olfactory epithelium, его клетки напрямую сообщаются с внешней средой), обонятельная луковица и задняя часть конечного мозга. Кроме них возбуждались два невромаста (группы клеток, чувствительных к механическим стимулам; компоненты боковой линии) в носу рыб. Активность ствола мозга, получающего информацию от вкусовых рецепторов, не была связана с подачей соленой воды.

Дальше нужно было выяснить, связана ли активность обонятельного эпителия и невромастов с ростом солености окружающей среды только по времени или еще и функционально. Исследователи на час помещали личинок данио в воду с сульфатом меди (CuSO₄) — соединением, убивающим чувствительные клетки как в невромастах, так и в обонятельном эпителии. Еще час малькам отводили на восстановление, а после начинали эксперименты, аналогичные тем, что показано на упоминавшемся выше видео. Чем выше была концентрация CuSO₄, с которой пришлось столкнуться рыбам, тем слабее они реагировали на подачу соленой воды к голове. При содержании сульфата меди в воде, равном 20 микромоль на литр, никаких реакций на изменение солености данио не демонстрировали. Сам по себе CuSO₄ не влиял на двигательные способности личинок и на их реакции на другие стимулы, к примеру, зрительные.

Чтобы определить, какие структуры важнее для восприятия солености — невромасты в носу или обонятельный эпителий, ученые в одной из серий опытов предварительно разрушали невромасты направленным действием лазера и смотрели, не станут ли рыбы реже дергать хвостом в ответ на подачу соленой воды. Реакции данио-рерио практически не изменились, а значит, основную роль в восприятии солености играет обонятельный эпителий. Невромасты боковой линии туловища тоже мало влияли на поведение личинок в соленой воде. В ряде опытов ее поток направляли не на голову рыбы, а на хвост. При такой конфигурации соленость воды менялась у задней части тела данио, и это теоретически могли определить расположенные на ней невромасты. До обонятельного эпителия и невромастов носа эти изменения практически не доходили: соль успевала разбавить пресная вода, подаваемая между стимулами. Но при подаче NaCl на хвост реакций обычно не следовало.

Итак, выяснилось, что изменения концентрации солей в воде определяют какие-то клетки обонятельного эпителия. Теперь предстояло выяснить, какие. Учитывая, что личинки данио избегали наличия любых ионов в воде, могло быть так, что специальных клеток для определения солености у них нет, и о ее изменениях рыба узнает благодаря тому, что Na⁺ или похожие заряженные частицы вошли в нейроны и тем самым возбудили их. В новой серии экспериментов ученые направляли на головы мальков воду то с NaCl, то с глицином (привлекает рыб), то с кадаверином (неприятен для данио), и отмечали, какие области обонятельного эпителия при этом флуоресцируют.

Оказалось, что на наличие хлорида натрия в воде реагирует примерно 5% групп клеток обонятельного эпителия и обонятельной луковицы (она получает сигналы от обонятельного эпителия). Остальные клетки к нему не чувствительны, зато некоторые из них возбуждаются в присутствии глицина или кадаверина. Следовательно, личинки данио определяют соленость небольшой специфической группой нейронов, а не всем обонятельным эпителием (рис. 4).

Какие молекулы на поверхности обонятельных нейронов реагируют на изменение концентрации соли и что за ионы с ними связываются (Na⁺, Cl⁻ или какие-то другие), пока не ясно: молекулярно-биологических экспериментов в этой работе не проводили. Вполне вероятно, что для ощущения солености требуется несколько видов белков-рецепторов (допустим, один для натрия, а другой для хлора). Как правило, обонятельные нейроны, на поверхности которых расположены одни и те же рецепторные белки, посылают сигналы в одни и те же клубочки (скопления контактов нервных клеток, см. Glomerulus) обонятельной луковицы. В случае с данио это было не так: в ответ на изменение солености возбуждались самые разные клубочки. Значит, для восприятия солености этим рыбам требуется активация сразу нескольких наборов клеток обонятельного эпителия с разными рецепторами на поверхности.

Перед нами первое исследование того, как костистые рыбы ощущают соленость, и оно, конечно, не дает исчерпывающей информации об этом чувстве. Пока данные получили только по одному виду, и не взрослым особям, а личинкам на одной из стадий развития. Вполне вероятно, что у мальков старше шести-семи дней образуются какие-то дополнительные структуры, регистрирующие изменение концентрации различных ионов в воде. Это можно будет проверить позже на данио. Кроме того, рыбка удобна тем, что ее генетика хорошо изучена, а значит, будет относительно легко выяснить, какие ее гены кодируют рецепторы к соленому. Пока авторы статьи предполагают, что эти рецепторы у данио-рерио похожи на белок pickpocket 23 дрозофилы, реагирующий на одновалентные ионы, а не на общее количество растворенных в воде частиц.

Источник: Kristian J. Herrera, Thomas Panier, Drago Guggiana-Nilo, Florian Engert. Larval Zebrafish Use Olfactory Detection of Sodium and Chloride to Avoid Salt Water // Current Biology. 2021. DOI: 10.1016/j.cub.2020.11.051.

Светлана Ястребова

Источник: elementy.ru

. .