В ходе адаптации к теплу или холоду ферменты находят одни и те же решения типовых эволюционных задач

Американские химики и биологи провели беспрецедентное по масштабу исследование закономерностей эволюции белков на примере адаптации ферментов к высоким и низким температурам. Адаптация к холоду, как правило, требует повышения каталитической активности фермента, а при высокой температуре на первый план выходит проблема стабильности его трехмерной структуры. Как выяснилось, баланс между активностью и стабильностью может определяться одним-единственным аминокислотным остатком в активном центре фермента. Например, если у фермента кетостероид-изомеразы в ключевой позиции №103 стоит аспарагиновая кислота (D103), фермент высокоактивен, но не очень стабилен, а если там находится серин (S103), то все наоборот. Самое интересное, что эти эффекты мало зависят от того, какие аминокислоты стоят во всех остальных позициях (это называют «слабым эпистазом»). В результате получается стандартный и легко проходимый эволюционный путь, доступный организмам с самыми разными версиями кетостероид-изомеразы. И действительно, в ходе адаптации к холоду в разных эволюционных ветвях бактерий много раз независимо закреплялся вариант D103, а в ходе адаптации к теплу — S103. Анализ 2194 типов ферментов (белковых семейств) у 5852 видов бактерий с известными геномами и температурными оптимумами показал, что эти особенности температурной адаптации — важность единичных замен, слабый эпистаз и вездесущие параллелизмы — характерны для многих ферментов.

Земная жизнь в ходе эволюции освоила широкий диапазон температурных условий. Одни организмы сохраняют активность при охлаждении до −15°C, другие выдерживают нагревание до +121°C. Важнейшую роль в температурной адаптации играет эволюционная «настройка» ферментов. Разные температурные условия предъявляют к ним очень разные требования. Высокие температуры грозят денатурацией, а значит, должны способствовать отбору на стабильность пространственной структуры ферментов. При низких температурах химические реакции, необходимые для жизни, замедляются. Поэтому адаптация к холоду, по идее, должна сопровождаться отбором на повышенную каталитическую активность ферментов. Действительно, при умеренных температурах порядка 20–40°C ферменты холодолюбивых микробов часто оказываются более активными, чем соответствующие (ортологичные) ферменты теплолюбивых микроорганизмов. Известно также, что температура, при которой ферменты данного микроба наиболее активны, довольно строго коррелирует с температурой, при которой микроб быстрее всего размножается.

Адаптация к различным температурным условиям — процесс, можно сказать, вездесущий, ведь всем живым существам приходится так или иначе приспосабливаться к определенному диапазону температур. Поэтому на примере температурной адаптации удобно изучать общие закономерности эволюции ферментов. Именно это и попытались сделать биологи и химики из Стэнфордского университета и Калифорнийского университета в Сан-Франциско, чья впечатляющая как по объему, так и по содержанию статья появилась 5 марта на сайте журнала Science. Ученые сосредоточились на ферментах бактерий, поскольку именно по бактериям накопилось больше всего необходимых для такого исследования данных: геномных, биохимических и экологических.

Для начала авторы досконально разобрались в механизмах температурной адаптации одного хорошо изученного фермента — кетостероид-изомеразы (ketosteroid isomerase, KSI). Затем они показали, что полученные выводы отчасти приложимы к тысячам других ферментов.

Фермент KSI катализирует изомеризацию двойных связей в молекулах стероидов. Это позволяет многим бактериям использовать стероиды в пищу. Ключевую роль в работе KSI играет так называемая оксианионная дырка (Oxyanion hole), расположенная в активном центре фермента и включающая два аминокислотных остатка (рис. 2, вверху). Обычно это остатки аспарагиновой кислоты в позиции 103 (обозначается как Asp103 или D103) и тирозина в позиции 16 (Tyr16 или Y16). Их задача — образовать водородные связи с одним из атомов кислорода в молекуле субстрата (то есть стероида, который нужно подвергнуть изомеризации).

Ученые сравнили хорошо изученную мезофильную (адаптированную к умеренным температурам порядка 30°C) версию KSI бактерии Pseudomonas putida (mesoKSI) с термофильным вариантом того же фермента (thermoKSI) из бактерии Mycobacterium hassiacum, которая хорошо растет при 65°C. Как и следовало ожидать, thermoKSI оказался более стабильным (устойчивым к нагреванию), а mesoKSI — более активным при умеренных температурах.

Аминокислотные последовательности mesoKSI и thermoKSI совпадают лишь на 33% (рис. 2, внизу), то есть это эволюционно довольно далекие друг от друга белки. Однако их трехмерные структуры, изученные авторами с большой тщательностью (в том числе при помощи рентгеноструктурного анализа), оказались почти одинаковыми (рис. 1, вверху). Это говорит о том, что большинство закрепившихся в ходе эволюции аминокислотных различий, скорее всего, не сильно повлияли на рабочие качества фермента.

Ключевое различие обнаружилось в строении активного центра (рис. 1, внизу). В позиции 103 у thermoKSI вместо аспарагиновой кислоты стоит серин (замена D103S). Изучение множества мутантных ферментов, в которых исследователи заменяли аминокислоты по одной или сразу по несколько, показало, что именно замена D103S вносит основной вклад как в повышенную стабильность, так и в пониженную активность thermoKSI по сравнению с mesoKSI. Небольшое влияние оказывают еще три аминокислоты, тоже находящиеся в активном центре и различающиеся у thermoKSI и mesoKSI (позиции 86, 88 и 101), но их роль второстепенна. Весь остальной аминокислотный «контекст», столь сильно различающийся у двух версий фермента (напомним, что у них совпадает лишь 33% аминокислот), практически не сказывается на том, как аминокислота в позиции 103 влияет на стабильность и активность. Поэтому если в белке mesoKSI просто заменить аспарагиновую кислоту на серин в позиции 103, ничего больше не меняя, то сразу получится фермент, похожий по своим свойствам на thermoKSI. И наоборот, если у thermoKSI провести обратную замену (S103D), то сразу получится фермент, похожий на mesoKSI по стабильности и активности. Если вдобавок к этой «главной» позиции поменять аминокислоты также и в трех «дополнительных» (86, 88, 101), сходство получится практически полным.

Это значит, что эпистаз (то есть влияние одних замен на эффекты других) не играет большой роли в температурной адаптации фермента KSI. Вопрос о роли эпистаза важен для понимания общих принципов эволюции белков, о чем «Элементы» неоднократно рассказывали (см. ссылки в конце новости). Сильный эпистаз означает, что эволюционные изменения, возможные в одном геномном контексте, будут нереализуемы в других. Слабый эпистаз соответствует более свободному перемещению белка в пространстве последовательностей (см.: Эволюция белков сдерживается низкой проходимостью ландшафта приспособленности, «Элементы», 09.02.2015). Результаты, изложенные в обсуждаемой статье, можно интерпретировать как аргумент в пользу не очень большой роли эпистаза — если не в эволюции белков в целом, то, по крайней мере, в температурной адаптации ферментов.

Исследование показало, что между версиями фермента KSI, настроенными на умеренные и высокие температуры, существует простой и легко проходимый эволюционный маршрут. Им неоднократно пользовались самые разные группы бактерий. Это оказалось возможным как раз благодаря слабому эпистазу, то есть тому факту, что конкретная аминокислотная замена приводит к одному и тому же результату вне зависимости от контекста. К этому выводу авторы пришли, проанализировав данные по тысячам видов бактерий. Оптимальные для этих видов температуры сопоставлялись с аминокислотными последовательностями KSI и с положением этих видов на эволюционном дереве. Выяснилось, что адаптация мезофильных бактерий к более высоким температурам часто сопровождалась заменой D103S. И наоборот, когда термофилы вдруг решали переселиться в места попрохладнее, с большой вероятностью происходила замена S103D. Три «дополнительные» позиции (86, 88 и 101) тоже обычно подтягивались к состоянию, оптимальному для данных температурных условий. Всё это происходило много раз независимо в разных эволюционных линиях.

Авторам удалось даже в общих чертах разобраться, почему замена аспарагиновой кислоты на серин в позиции 103 снижает активность, но повышает стабильность фермента. Для высокой активности нужно, чтобы аминокислотный остаток образовывал сильную водородную связь с субстратом. Это у аспарагиновой кислоты получается лучше, чем у серина (рис. 1, внизу). Стабильность же требует, чтобы аминокислотный остаток был в протонированном состоянии, то есть заканчивался группой -OH, а не -O⁻. У аспарагиновой кислоты с этим проблемы (она же всё-таки кислота), а у серина — нет.

Таким образом, слабый эпистаз обеспечивает существование простого и универсального эволюционного маршрута между версиями KSI, приспособленными к разным температурам. Это, в свою очередь, приводит к многочисленным случаям параллельной эволюции.

Чтобы понять, насколько общей является эта закономерность, авторы проанализировали данные по 2194 семействам ферментов у 5852 видов бактерий, для которых известны геномы и оптимальные температуры. Для каждого фермента, каждой аминокислотной позиции в этом ферменте и каждой из 20 аминокислот, которые в принципе могут стоять в этой позиции, ученые искали связь с температурой. Иными словами, был проведен целенаправленный поиск позиций, в которых частота встречаемости тех или иных аминокислот достоверно зависит от температуры. Если слабый эпистаз, наличие стандартных эволюционных маршрутов и многочисленные параллелизмы — общие правила температурной адаптации ферментов, то следует ожидать, что таких «температурозависимых» позиций и аминокислот найдётся очень много.

Это ожидание подтвердилось. Как минимум одна температурозависимая позиция нашлась почти у половины ферментов (1005 из 2194). Судя по тому, как аминокислоты, стоящие в этих позициях, распределены по эволюционному дереву, параллелизмы в эволюции этих ферментов происходили сплошь и рядом.

Остальные 1189 ферментов, очевидно, не нашли универсальных (то есть не подвластных эпистазу) путей температурной адаптации. Они, наверное, делают это другими способами, не такими универсальными, а подходящими только для определенных аминокислотных контекстов. Но в данном исследовании речь не о них.

В общей сложности исследователи нашли более 158 тысяч статистически значимых ассоциаций между температурой и определенной аминокислотой в определенной позиции определенного фермента. Один из примеров показан на рис. 3.

В итоге получился внушительный массив данных по стандартным (высоковероятным) путям температурной адаптации ферментов. В этом массиве еще долго можно будет искать всякие интересные закономерности. Некоторые из них уже найдены авторами и описаны в обсуждаемой статье. Вот один пример. Ранее уже высказывалась идея, что эволюция термоустойчивости белков может сопровождаться ростом частоты встречаемости аминокислотных остатков с разветвленными цепями (изолейцина, лейцина и валина) в гидрофобной сердцевине белковой молекулы. Разветвленные цепи скрепляют ее наподобие клея. Новые данные показали, что частота встречаемости изолейцина действительно растет с увеличением температуры, но для лейцина и валина такой закономерности обнаружить не удалось. Видимо, это значит, что изолейцин является более универсальным (контекстно-независимым) клеем, чем лейцин и валин. Более того, оказалось, что две самые частые аминокислотные замены, происходящие при адаптации ферментов к высокой температуре — это замены лейцина и валина на изолейцин. Авторы предполагают, что изолейцин склеивает белковую молекулу лучше, чем валин, так как у него длиннее гидрофобная боковая цепь, и лучше, чем лейцин, потому что эта цепь у него асимметрична, может по-разному поворачиваться и легче встраивается в разнообразные пустоты во внутренней части белковой молекулы.

Обнаруженные авторами стандартные пути температурной адаптации ферментов иногда представляют собой единичные аминокислотные замены, но во многих случаях речь идет о согласованной замене двух или более аминокислот. Такое должно чаще происходить с аминокислотами, которые как-то взаимодействуют друг с другом, а значит, в трехмерной белковой молекуле они должны находиться по соседству (примерно как позиции 103, 86 и 101 у фермента KSI, см. рис. 1). Целенаправленный поиск таких контактирующих и при этом согласованно меняющихся групп аминокислот позволил обнаружить их более чем у половины (525 из 1005) ферментов, имеющих хотя бы одну температурозависимую позицию. В большинстве случаев это пары, но встречаются и тройки, и более многочисленные группы взаимодействующих аминокислот, имеющих обыкновение согласованно меняться в ходе температурной адаптации.

Обсуждаемая работа имеет как теоретическое, так и практическое значение. Составленная авторами база данных по аминокислотным заменам, ассоциированным с температурной адаптацией, будет полезна при проектировании искусственных белков с заданными свойствами. С теоретической точки зрения важен вывод о том, что температурная адаптация часто (хоть и далеко не всегда) идет по стандартным, высоковероятным эволюционным маршрутам, универсальность которых обеспечивается слабым эпистазом. Это ведет к бесчисленным параллелизмам: самые разные версии фермента, даже сильно отличающиеся друг от друга по аминокислотной последовательности, раз за разом находят одно и то же простое решение типовой эволюционной задачи.

Источник: elementy.ru

. .