Биспецифичные антитела помогают Т-клеткам распознавать раковые клетки по точечным мутациям

Исследователям из университета Джонса Хопкинса удалось опознать и обезвредить раковые клетки по их специфичным внутренним белкам, отличающимся от нормальных белков заменой всего одной аминокислоты. Это было сделано при помощи иммунотерапии биспецифичными антителами, которые четко узнавали эти клетки со сломанным белком p53 и призывали к ним Т-киллеров. При этом здоровые клетки с обычным вариантом этого белка, которых в организме гораздо больше, полностью игнорировались. Пока этот подход опробован только in vitro и на мышах, но в будущем он может серьезно продвинуть лечение раков с поломками в белке p53.

Иммунотерапия позволяет организму бороться со злокачественной опухолью его же Т-клетками, переобученными в лаборатории на распознавание и уничтожение новообразования. Задача по поиску идентификаторов для иммунной системы, на основании которых она будет принимать решение о том, злокачественная клетка или нет, ложится в этом случае на плечи ученых. На эту роль замечательно подходят неоантигены, — специфичные для опухоли мутантные белки, которых нет в клетках здоровых тканей организма. Чуть хуже подходят белки, которые часто встречаются в опухолевых клетках и редко — в здоровых: если иммунная система будет уничтожать все клетки с таким белком, то пострадают и полезные клетки. Тем не менее, именно такие белки и составляют большинство хорошо изученных мишеней для иммунотерапии. Примером может служить белок CD19, который в изобилии есть на поверхности клеток лимфомы и нормальных B-клеток. В ходе иммунотерапии Т-клетки нападают на все клетки, несущие на себе этот белок, но затем популяция нормальных клеток восстанавливается за счет созревания новых.

Неоантигены — гораздо более сложная цель. Во-первых, переобученные иммунные клетки должны хорошо отличать мутантные белки от обычных. Это не всегда просто, ведь порой они отличаются всего на одну аминокислоту. Во-вторых, клетка должна вырабатывать этот мутантный белок в изобилии и, главное, демонстрировать его иммунной системе. Напрямую она видит только белки расположенные на поверхности клетки, а доступ ко внутреннему содержимому осуществляется через главный комплекс гистосовместимости (ГКГС или MHC — от major histocompatibility complex). На этой структуре, расположенной на мембране всех ядерных клеток организма, иммунной системе демонстрируются кусочки белков клетки.

Разные пептиды взаимодействуют с ГКГС с разной охотой, и для поимки опухолевой клетки по неоантигену нужно, чтобы его кусочек с мутацией активно выставлялся на ГКГС. Количество неоантигена в клетке тоже играет свою роль — чем его больше, тем больше шансов, что он будет узнан иммунной системой.

Таким образом, одни из самых сложных для поимки неоантигенов — это внутренние белки клетки с точечными мутациями и умеренным уровнем экспрессии. Тем не менее, как показывают две новые работы, выполненные в лаборатории Шибина Чжоу (Shibin Zhou) из онкологического центра Сидни Киммела Университета Джонса Хопкинса, эта задача выполнима.

Чжоу с коллегами выполнили провели эксперименты с двумя разными неоантигенами, при этом суть обеих работ очень близка. В первой статье, опубликованной в журнале Science, они описали, как включить иммунный ответ так, чтобы он уничтожил клетки с мутантным белком p53. Вторую работу (опубликованную в тот же день в журнале Science Immunology) посвятили клеткам с мутантными белками семейства RAS.

Белок p53 как раз относится к сложным неоантигенам. Это ключевой онкосупрессор, который активен в нормальных клетках, а его выключение и/или неспособность выполнять свою работу приводят к неконтролируемому делению клеток. Хотя поломки в гене TP53, кодирующем этот белок, встречаются в большинстве раков, целевого лечения до сих пор нет.

В опухолевых клетках этот ген работает плохо, так что на их ГКГС, где он может быть узнан иммунной системой или иммунотерапевтическими препаратами, белка p53 не больше, чем на обычных клетках. Можно попытаться отличать опухолевые клетки по мутациям в p53, но это необходимо делать очень аккуратно — здоровых клеток с обычным p53 много, и ошибочное признание этих клеток раковыми может дорого стоить организму.

Типичные раковые мутации в гене TP53 — это одиночные замены в участке, кодирующем ДНК-связывающий домен белка. Самая распространенная такая мутация (и самая распространенная мутация в онкосупрессорах вообще) — R175H, замена аргинина (R) на гистидин (H) в 175 позиции белка. Именно ее исследователи и выбрали в качестве своей цели.

RAS — это целое семейство протоонкогенов. С поломками входящего в него, например, гена KRAS связано примерно 20% всех раков и лишь недавно для него удалось подобрать удачный вариант таргетной терапии (см. новость «Неподдающийся» онкоген KRAS сдает позиции, «Элементы», 09.06.2020). В случае мутаций количество соответствующего белка внутри клеток вырастает, но из-за того, что на поверхности клетки он появляется только на ГКГС и порезанным на кусочки, поймать его при помощи иммунотерапии до настоящего момента не получалось. Исследователи попробовали научить иммунную систему распознавать при помощи биспецифичных антител две самые распространенные мутации, которые могут быть у трех генов семейства RAS: G12V (замена глицина на валин в 12 позиции) и Q61H/L/R (замена глутамина на гистидин, лейцин или аргинин в 61 позиции).

Обе работы выстроены по одному принципу: исследователи нашли нужный антиген, разработали антитела, проверили их эффективность in vitro и in vivo на мышах, а также удостоверились в их специфичности.

По данным исследователей кусочек белка p53 с нужной мутацией, HMTEVVRHC (цветом отмечено место мутации), может выставляться в качестве эпитопа на поверхности клетки в составе одного из распространенных вариантов ГКГС (аллель A*02:01), а значит, он может быть найден там биспецифичными антителами.

В качестве основы для антиген-распознающей половинки препарата ученые взяли антитела, мимикрирующие под настоящий Т-клеточный рецептор: они тоже узнают пептиды в комплексе с ГКГС, но связываются с ним прочнее. При помощи фагового дисплея исследователи проверили огромное количество таких антител на их способность узнавать комплекс ГКГС:HMTEVVRHC и получили два подходящих варианта, отличающихся по способности связываться с нормальным вариантом белка p53 (ГКГС:HMTEVVRRC). Поскольку от антитела требовалась максимальная специфичность, для дальнейшей разработки был выбран тот вариант, который совсем не связывался с обычным p53 даже в высоких концентрациях.

Определившись с антиген-специфичной половинкой препарата, исследователи сшили ее со второй частью, активирующей Т-киллера. Есть несколько общеупотребительных вариантов этих деталек, исследователи проверили их и выбрали самый эффективный.

Работоспособность конструкции исследователи проверили in vitro и in vivo, на мышах. Ученые выбрали десять клеточных линий, которые отличались по присутствию и отсутствию замены R175H и по активности нужного аллеля ГКГС. При культивации антител и Т-клеток они ожидали увидеть дозозависимую активацию Т-клеток в тех линиях, клетки которых имели мутацию. В целом так и было (рис. 2), причем T-клетки активировались даже при следовых концентрациях антител.

Аналогичные наблюдения авторы работы получили и в экспериментах, в которых они сравнили пары из обычных клеточных линий и тех же линий с измененной активностью генов ГКГС/обычного/мутантного p53.

Важным для активации Т-клеток фактором закономерно оказалось количество белковых комплексов ГКГС на поверхности клеток: чем их больше, тем больше на них попадало мутантных пептидов и тем лучше шла активация клеток. Это наблюдение может сыграть важную роль на практике, ведь спрятать ГКГС с поверхности — это распространенная тактика, благодаря которой раковые клети приобретают устойчивость против иммунной системы.

Проверка биспецифичных антител на мышах, которым предварительно вкололи опухолевые клетки (с мутантным p53) и человеческие Т-клетки, тоже дала положительные результаты. Опухоли у мышей, пролеченных биспецифичными антителами, практически исчезли, тогда как в контрольных группах их рост продолжался в течение всего эксперимента.

Чтобы понять причины, по которым антитело получилось таким специфичным, ученые определили третичную структуру центрального участка комплекса «антитело — мутантный p53 — ГКГС», на котором происходит взаимодействие трех молекул. Выяснилось, что мутантная и соседняя с ней аминокислоты играют важную роль в узнавании пептида антителом: именно с ними у антитела формируется больше всего контактов. Кроме того, исследователи последовательно мутировали каждую из аминокислот пептида и экспериментально проверили способность этих пептидов связываться с антителами и активировать Т-клетки. Выяснилось, что первая аминокислота у этого пептида может оказаться практически любой (рис. 3).

In vitro результаты по белкам RAS тоже получились удачными: разработанные антитела видели те небольшие количества мутантных пептидов, которые попадали в ГКГС и наоборот, игнорировали клетки с нормальными белками RAS. В экспериментах на мышах антитела, хоть и не устраняли опухоли полностью, но замедляли их рост.

Обсуждаемые работы — вне зависимости от того, насколько исследованные в них антитела окажется возможным использовать на практике, — продемонстрировали целый ряд важных моментов. Впервые была показана возможность иммунотерапии для ключевых внутриклеточных неоантигенов, p53 и RAS. Их мутантные кусочки попадают на поверхность клетки в очень небольших количествах, но несмотря на это их удалось обнаружить при помощи биспецифичных антител и вызвать иммунный ответ. И хотя эти целевые пептиды отличаются от нормальных всего на одну аминокислоту, этого достаточно, чтобы антитела не путали их между собой. Разумеется, до применения таких биспецифичных антител в медицинской практике еще очень далеко, первый шаг к этому уже сделан.

Источник: elementy.ru

. .