Методом редактирования оснований удалось вылечить модельные генетические заболевания у мышей и макак

Генетические заболевания часто возникают из-за замены всего лишь одного нуклеотида в геноме. Методы на основе системы CRISPR/Cas9, которые могут исправить либо цитозин на тимин, либо аденин на гуанин в нужной позиции, — так называемое редактирование оснований — появились буквально несколько лет назад, но уже используются для исправления мутаций у лабораторных животных. Недавно группе американских исследователей удалось исправить мутацию в гене β-глобина, ответственную за развитие серповидноклеточной анемии, а другой международной группе ученых — создать мутантный вариант гена PCSK9, который снижает уровень липопротеинов низкой плотности. Обе работы используют модернизированные версии метода редактирования оснований (base editing). Еще неизвестно, будет ли такой подход использоваться в клинической практике, но если это произойдет, то он поможет многим людям вернуться к нормальной жизни.

Примерно половина всех вариантов генома человека, которые связаны с патологическими состояниями, возникают при изменении всего лишь одного нуклеотида в последовательности ДНК (это может происходить при замене, вставке или делеции). Часто такие изменения в геноме наблюдаются уже у родителей, но проявляются в виде патологии у детей, если при оплодотворении встретились гаметы, несущие изменения. Также однонуклеотидные замены могут возникнуть и спонтанно в процессе образования половых клеток. Такое изменение может нарушить работу одного белка, чего бывает достаточно, чтобы развилось серьезное заболевание (например, серповидноклеточная анемия), или может внести вклад в многофакторные заболевания (атеросклероз, болезнь Альцгеймера и многие другие). Создание методов генной терапии в первую очередь направлено на исправление таких изменений.

С тех пор как ученые освоили применение бактериальной «иммунной системы» — CRISPR/Cas9 — для внесения изменений в генетическую информацию в клетках, у них появилась возможность моделировать заболевания путем создания мутаций в участках генома, соответствующих мутациям у пациентов, и использовать их, например, для подбора подходящей медикаментозной терапии (подробнее об освоении этой методики направленного геномного редактирования читайте в новостях Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR, «Элементы», 13.07.2017 и Нобелевская премия по химии — 2020, «Элементы», 12.10.2020). В то же время эти мутации можно направленно исправлять в организме модельных животных, создавая базу для будущей генетической терапии этих заболеваний.

Серповидноклеточная анемия вызывается однонуклеотидной заменой в гене β-глобина (субъединицы бета гемоглобина, HBB), которая приводит к замене глутамата (GAG) на валин (GTG). Молекулы такой аномальной формы гемоглобина (HbS) «слипаются» в волокна, меняя форму эритроцитов, снижая их способность переносить кислород, что приводит к повреждению и закупорке сосудов. Механизм этого процесса очень хорошо изучен, поэтому серповидноклеточная анемия является практически модельным заболеванием для генной терапии. Сейчас вылечить это заболевание можно только пересадкой костного мозга. Эта процедура требует, во-первых, поиска подходящего донора, а во-вторых, огромной нагрузки на организм пациента.

В научной литературе уже описаны относительно удачные попытки редактировать мутацию в гемопоэтических стволовых клетках пациентов с помощью нуклеаз с «цинковыми пальцами» (см. Zinc finger nuclease): у прошедших терапию образовались нормальные формы гемоглобина (M. D. Hoban et al., 2015. Correction of the sickle cell disease mutation in human hematopoietic stem/progenitor cells). В 2016 году исследователи из США представили работу, где такое же редактирование было проведено с помощью системы CRISPR/Cas9 (M. A. DeWitt et al., 2016. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells). Им удалось исправить мутацию в культурах гемопоэтических стволовых клеток пациентов с эффективностью 32%, а затем ввести их в организм мышей с дефектным иммунным ответом (стандартный подход для изучения поведения человеческих клеток в организме мышей). Полученные клетки сохранялись в кровотоке мышей как минимум 16 недель, хоть и в небольшой концентрации (около 2% от общего числа гемопоэтических клеток), но этого скорее всего достаточно для клинического улучшения. Несмотря на успех, редактирование этой мутации пока не перешло в стадию клинических исследований.

В 2020 году сообщалось об успешной терапии пациентов с серповидноклеточной анемией (H. Frangoul et al., 2020. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia). В этом клиническом исследовании терапия была основана на другом подходе. Гемоглобин взрослого человека содержит две молекулы α-глобина и две β-глобина. Симптомы пациентов с серповидноклеточной анемией начинают проявляться в течение первого года жизни, когда в эритроцитах он замещается на взрослую форму, содержащую патогенную замену. Но до этого у детей-носителей никаких симптомов не проявляется, потому что в его эритроцитах еще содержится фетальный гемоглобин, который состоит из двух молекул α-глобина и двух — γ-глобина. В указанной работе у пациентов с помощью CRISPR/Cas9 смогли запустить работу гена фетального гемоглобина в клетках-предшественников эритроцитов. Клинические исследования такого подхода к лечению серповидноклеточной анемии еще продолжаются.

Но что же останавливает исследователей от простого подхода: исправления одного единственного нуклеотида в геноме пациентов с серповидноклеточной анемии? Одна из главных причин — недостатки системы CRISPR/Cas9.

Восстановление двуцепочечного разрыва, который образует эндонуклеаза Cas9, основано на двух путях репарации ДНК. Негомологичное соединение концов (рис. 1, слева) — менее точный метод, который приводит к небольшим инсерциям (вставкам фрагментов ДНК) или делециям (удалению фрагментов). Именно такие изменения в геноме желательны, если цель редактирования — исправить нарушение работы какого-то участка ДНК. Например, в клинических исследованиях CRISPR-терапии серповидноклеточной анемии целевой участок ДНК находился в гене фактора транскрипции (см. Transcription factor) BCL11A. Нарушение работы BCL11A приводит к усилению экспрессии гена фетального гемоглобина. При таком подходе важен сам факт нарушения работы гена, а не «побуквенное» исправление. Для исправления замены одного нуклеотида, например в гене гемоглобина B, исследователи надеялись на второй путь репарации — гомологичную рекомбинацию. В клетки помимо Cas9 и гидовой РНК вводят ДНК-шаблон с нормальной версией гена гемоглобина. Исправление мутации действительно удалось, но в 33% случаев авторы наблюдали ненужные делеции и вставки. Какой из этих двух механизмов будет использовать клетка для восстановления двуцепочечного разрыва, зависит от типа клеток. Кроме того, гомологичная рекомбинация работает только в определенные фазы клеточного цикла, и два типа репарации конкурируют между собой. Чаще всего негомологичное соединение концов побеждает. Помимо этого, в ответ на двуцепочечные разрывы ДНК активируется ген TP53, что может привести к апоптозу клеток.

Стратегии геномного редактирования, которые позволяют избежать двуцепочечных разрывов ДНК и их репарации, стали разрабатываться довольно быстро, и в 2016 году был опубликован новый подход к исправлению мутаций — редактирование оснований (рис. 2).

В системах редактирования оснований также присутствует фермент Cas9, однако в дефектной форме (которая называется никазой, см. nickase), которая делает всего один разрез цепи ДНК. Такой одноцепочечный разрез как бы помечает тот нуклеотид, который должен быть заменен. Присутствует и гидовая РНК, которая направляет Cas9 к целевому участку ДНК. Но самое важное отличие — ферменты, которые модифицируют азотистые основания на ДНК (см. рис. 2).

Первая система — способ редактирования цитозиновых оснований, который заменяет комплементарные пары C•G на T•A. Она содержит фермент цитидиндеаминазу (см. APOBEC), которая дезаминирует цитозин, превращая его в урацил. В норме на урацил в ДНК реагируют механизмы эксцизионной репарации оснований, и фермент урацилгликозилаза вырезает урацил из ДНК. Чтобы сохранить урацил, разработчики системы добавили фаговый пептид, который ингибирует урацилгликозилазу.

Вторая система — способ редактирования адениновых оснований, который заменяет пары T•A на C•G. Система также содержит фермент, модифицирующий аденин, превращая его в инозин. Интересно, что в природе фермента, который мог бы делать такую модификацию в ДНК, не существует. Поэтому исследователи получили такой фермент с помощью искусственной эволюции на основе фермента TadA кишечной палочки (см. новость Методом искусственной эволюции создан новый фермент для редактирования геномов, «Элементы», 31.10.2017). Системы репарации игнорируют инозин в ДНК, поэтому дополнительных элементов в систему добавлено не было. После превращения цитозина в урацил или аденина в инозин при репарации или репликации ДНК напротив них встает аденин или гуанин, соответственно (подробно метод редактирования оснований описан в новости Новый метод редактирования генома аккуратнее и эффективнее, чем CRISPR/Cas9, «Элементы», 29.10.2019).

Оба метода с самого своего появления казались привлекательными для исправления однонуклеотидных замен, связанных с заболеваниями человека. В первой публикации о CBE описано успешное исправление мутации в варианте IV гена аполипопротеина E (APOE4), связанной с развитием болезни Альцгеймера, а также мутации в гене TP53, связанной с некоторыми типами рака (A. Komor et al., 2016. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage). В первой публикации об ABE авторы исправили мутацию в гене HFE, приводящую к наследственному гемохроматозу, а также смоделировали мутации в промоторах генов HBG1и HBG2, которые обеспечивают сохранение фетального гемоглобина, а значит потенциально могут использоваться для лечения серповидноклеточной анемии (N. Gaudelli et al., 2017. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage).

В статье, опубликованной недавно в журнале Nature, американские исследователи под руководством Дэвида Лиу (David R. Liu) — основоположника редактирования оснований — смогли исправить ту самую мутацию в гене β-глобина, которая приводит к образованию аномальной формы гемоглобина HbS и серповидноклеточной анемии. Правда, исправить кодон GTG (Val) напрямую на GAG (Glu) с помощью ABE невозможно, но можно заменить на естественно встречающийся непатогенный вариант GCG (кодирующий аланин, Ala) (Hb-Makassar, названный по городу Макасар в Индонезии, где впервые обнаружили этот вариант).

Для исправления мутаций авторы использовали разработанное ими ранее последнее поколение ABE, которое более эффективно находит целевые последовательности и заменяет пары T•A на C•G. В гемопоэтические клетки доноров с серповидноклеточной анемией вводили либо гибридный белок ABE (Cas9-никазу и аденозиндеаминазу) вместе с гидовой РНК, либо мРНК, кодирующую ABE и гидовую РНК. Введение белка и РНК привело к привело к 80-процентному исправлению мутации, тогда как для мРНК-конструкции эффективность составила 44±5,9%. Однако второй подход (введение только мРНК) обеспечил меньшее количество нежелательных вставок и делеций.

Редактированные клетки дифференцировали в эритроидные предшественники, которые экспрессируют белки β-глобинового локуса (см. Human β-globin locus). При этом в редактированных клетках обнаружили в пять раз меньше дефектного гемоглобина, чем в контроле (рис. 3, с). Редактирование также не повлияло на возможность дифференцировки клеток, а также улучшило сопротивляемость молодых эритроцитов (ретикулоцитов) к гипоксии: они менее охотно превращались в серповидные клетки (рис. 3, d, e). Эффективность этого процесса зависела от того, какой метод введения системы использовался, однако авторы не обсуждают причины таких различий.

Тем не менее, авторы подробно исследовали возможность нецелевых мутаций. Во-первых, они провели биоинформатический анализ, с помощью которого обнаружили 140 участков ДНК, содержащих последовательность PAM и последовательность, комплементарную целевой за исключением 1–3 оснований. Во-вторых, авторы использовали in vitro метод оценки количества нецелевых мутаций CIRCLE-seq (). Всего было обнаружено 725 потенциальных сайтов, 697 из которых подтверждены секвенированием генома. Только 54 из них соответствовали замене T•A на C•G. При использовании сочетания ABE и РНК нецелевые мутации встречались реже, вероятно из-за того, что комплекс активен только в течение короткого времени (рис. 3, f–h).

Наконец, модифицированные гемопоэтические клетки вводили иммунодефицитным мышам и наблюдали за тем, как они дифференцировались в предшественники эритроцитов. Через 16 недель костный мозг мышей на 70% состоял из человеческих клеток, при этом они вели себя также как и контрольные, немодифицированные клетки. В отредактированных предшественниках эритроцитов уровень дефектного β-глобина снизился более, чем в два раза.

Эритроциты человека имеют короткий срок жизни в организме мышей. Чтобы изучить, как будут вести себя отредактированные предшественники эритроцитов и как это отразится на здоровье животных, авторы пересаживали их мышам линии Townes (рис. 4). У этих мышей собственные гены α- и β-глобина заменены на человеческие, при этом присутствует мутация, вызывающая серповидноклеточную анемию. У мышей с двумя аллелями HBB^S развиваются соответствующие симптомы. Мышам вводили модифицированные клетки и отбирали образцы крови через 6, 10, 14 и 16 недель, чтобы оценить, насколько функциональны модифицированные клетки. На 10-й неделе у всех мышей прижились 90% донорских клеток. Количество исправленного β-глобина в эритроцитах составляло 75–82% на протяжении всего эксперимента. Такие эритроциты жили дольше, так как на 16-й неделе модификация наблюдалась только в 44% отредактированных гемопоэтических клеток.

Общий анализ крови показал, что у мышей, получивших неотредактированные клетки, видны все признаки серповидноклеточной анемии: не только вытянутые, но и фрагментированные эритроциты, а также снижение уровня эритроцитов и лейкоцитов. У мышей с отредактированными клетками эти параметры были похожи на показатели здоровых мышей.

Редактирование мутации, вызывающей серповидноклеточную анемию, — не первая попытка использовать ABE для коррекции патогенных мутаций. В начале 2021 года группа американских исследователей под руководством того же Дэвида Лиу использовала специально разработанный ABE для исправления мутации в гене ламина А. Эта мутация вызывает синдром Хатчинсона — Гилфорда — детскую форму прогерии (ускоренного старения) (L. W. Koblan et al., 2021. In vivo base editing rescues Hutchinson–Gilford progeria syndrome in mice). Исправить ее удалось как в фибробластах детей с прогерией, так и в мышиной модели этого заболевания. Всего одно введение аденоассоциированного вируса, экспрессирующего ABE, увеличило жизнь мышей с 215 до 510 дней.

В мае 2021 года вышла еще одна статья с описанием того, как с помощью ABE была внесена мутация, которая нарушает работу гена PCSK9 (пропротеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9). Этот ген в основном экспрессируется в печени и регулирует рецепторы липопротеинов низкой плотности (см. Low-density lipoproteins) — одних из основных переносчиков холестерина в крови. Белок PCSK9 связывается с рецепторами, вызывая деградацию холестерина. Если этих рецепторов слишком мало, то нарушается метаболизм липопротеинов низкой плотности и увеличивается их уровень в крови. Поэтому снижение активности этого гена должно приводить к снижению уровня холестерина, особенно при наследственных формах гиперхолестеринемии. Использование ABE дает большое преимущество при работе с клетками печени. Так как гепатоциты обновляются каждые 200–300 дней, двойные разрывы в ДНК в этих клетках репарируются с помощью негомологичного воссоединения концов, то есть более мутагенного пути. Внесенные с помощью ABE мутации приводит к нарушению сплайсинга мРНК PCSK9. В гепатоцитах мышей эффективность редактирования составила 84 ± 4,6%.

Далее авторы использовали аденовирус-ассоциированные векторы, чтобы доставить различные варианты ABE в клетки печени мышей, где через 6 недель максимальная эффективность редактирования составила 60 ± 18% (рис. 5). Уровень липопротеинов низкой плотности снижался при этом в почти пять раз.

Аденоассоциированные векторы надолго остаются в неделящихся клетках, например гепатоцитах. Это может способствовать появлению дополнительных нежелательных мутаций (помимо целевой) из-за работы ABE. Поэтому авторы протестировали доставку ABE с помощью мРНК, заключенных в липидную оболочку (рис. 5, b). В этом случае в 86,9 ± 1,9% клеток печени наблюдалось редактирование. Что касается дополнительных мутаций, то авторы не обнаружили значительного увеличения перехода A в G и вставок и делеций.

Вдохновленные результатом исследователи решили провести эксперимент на макаках-крабоедах — одной из наиболее близких к человеку доклинических моделей. Обезьянам вводили липидные частицы, которые содержали гидовую РНК, необходимую для нарушения синтеза PCSK9, а также мРНК, кодирующую самый успешный вариант ABE. Препарат вводили однократно или каждые две недели. Обезьяны хорошо переносили введение РНК, анализы крови незначительно отличались от нормальных.

После 29 дней эксперимента животных умерщвляли и оценивали уровень редактирования клеток печени. Даже в условиях двукратного введения высокой дозы препарата мутация наблюдалась только в 24,14 ± 1,52% клеток печени. Это значительно ниже, чем у мышей. Это очень важный результат, который показывает, что важно использовать подходящие животные модели. Уровень липопротеинов низкой плотности при этом снижался на 19%.

В обеих публикациях авторы отмечают, что использование ABE в целом не приводит к значительному количеству нежелательных изменений в геноме. Это хорошая новость с точки зрения потенциального использования редактирования оснований в генной терапии. В течение жизни мы накапливаем большое количество мутаций в клетках, поэтому скорее всего небольшое количество дополнительных изменений генома не приведет к клиническим последствиям. То, что ABE, по крайней мере, не увеличивают активность гена TP53 дает надежду на то, что эти мутации не приведут к злокачественным изменениям и другим последствиям.

Тем не менее, от использования редактирования оснований в генной терапии нас отделяет еще много исследований. Во-первых, нужно развивать методы, которые позволят уменьшить количество вставок и делеций в клетках, в которые попадает ABE. Это касается как способа введения системы (в виде мРНК или в виде комплекса из белка и гидовой РНК), так и выбора подходящей системы в случае быстро обновляющихся (например, костного мозга) или медленно обновляющихся тканей (например, тканей печени). Во-вторых, важно увеличить эффективность редактирования, что по-прежнему остается проблемой для CBE. Кроме того, обе системы помимо ДНК способны модифицировать рибонуклеотиды в составе РНК, что может повлиять на синтез белка в целевых клетках.

В любом случае, редактирование оснований — это новый и вдохновляющий метод, на котором может быть основана медицина будущего.

Источник: elementy.ru

Adblock test .