Опоссумы-альбиносы стали первыми генетически отредактированными сумчатыми

Биологи впервые отредактировали геном сумчатого млекопитающего. Им оказался домовый опоссум, популярное лабораторное животное. Воспользовавшись инструментом CRISPR/Cas9, исследователи отключили в зиготах этих зверьков ген Tyr и получили детенышей-альбиносов. Как отмечается в статье для журнала Current Biology, чтобы добиться успеха, ученым пришлось придумать, как заставить опоссумов спариваться в нужное время и как проникнуть сквозь плотную оболочку их яйцеклеток.

Домовые опоссумы (Monodelphis domestica) могут показаться совершенно непримечательными созданиями: они мелкие, скромно окрашенные и напоминают мышей. Однако биологи высоко ценят этих южноамериканских сумчатых как лабораторных животных. Все дело в особенностях их размножения: после четырнадцати дней беременности самка домового опоссума рождает детенышей, которые находятся на стадии, соответствующей тринадцати-пятнадцатидневным эмбрионам мышей и крыс или сорокадневным эмбрионам человека. При этом все последующие дни юные опоссумы растут вне тела матери, прикрепившись к ее соскам, и даже не прячутся в сумке, которая у представителей данного вида отсутствует, так что отслеживать их развитие очень удобно. Неудивительно, что многие исследования онтогенеза проводятся именно на домовых опоссумах. Кроме того, эти сумчатые помогают изучать строение мочеполовой системы, инактивацию X-хромосомы и геномный импринтинг.

В 2007 году домовый опоссум стал первым сумчатым, геном которого секвенировали. Однако отредактировать геном данного вида, как, впрочем, и любых других сумчатых, до сих пор не удавалось никому. Это сильно ограничивало использование опоссумов в экспериментах, поскольку у биологов не было возможности включать или выключать работу отдельных генов этих животных для изучения их функций.

Исправить положение решила команда специалистов во главе с Хироси Киёнари (Hiroshi Kiyonari) из Института физико-химических исследований (RIKEN). Первая проблема, которую они должны были решить, заключалась в том, чтобы синхронизировать забор зигот у одних самок опоссумов с подготовкой псевдобеременных самок-реципиентов, которым предстояло вынашивать эмбрионы. Сделать это оказалось непросто, поскольку овуляция у данного вида не циклична, а вызывается внешними стимулами, в первую очередь запахом самца. При этом пара опоссумов остается в месте в течение несколько недель, время от времени спариваясь. Такая репродуктивная система плохо подходит для отлаженного забора зигот.

Исследователи продемонстрировали, что если ввести самкам гонадотропин сыворотки жеребых кобыл, они спариваются в основном на третью ночь после встречи с самцом, в то время как без обработки это происходит на четвертую-седьмую ночь. А если дополнить эту процедуру инъекцией хорионического гонадотропина человека, окно спаривания сократится еще сильнее: 70 процентов самок будут совокупляться на четвертую ночь. Впрочем, обработка гормонами не повысила выработку зигот по сравнению с контрольной группой, а слишком большие дозы и дополнительная обработка человеческим гонадотропином даже уменьшили их производство, в некоторых случаях — до ноля. В дальнейшей работе авторы использовали зиготы, полученные как от самок, обработанных гормонами, так и от самок из контрольной группы.

Домовые опоссумы спариваются в ночное время, а оплодотворенная яйцеклетка достигает матки за 24 часа, поэтому Киёнари и его коллеги предположили, что забор зигот лучше всего производить на второе утро после спаривания, то есть через 30-34 часа после совокупления. Однако подопытные опоссумы начинали спариваться сразу после выключения света в 21:00, так что зиготы, собранные в ходе первых попыток, оказались старше 34 часов и плохо подходили для генного редактирования: они покрылись оболочкой, характерной для зигот опоссумов и слишком твердой для стандартных микроинъекций, а их пронуклеусы стали невидимыми. Лишь сдвинув время выключения света и, соответственно, начало спаривания на полночь, исследователи смогли получить более свежие зиготы, лучше подходящие для дальнейших манипуляций (хотя и они были покрыты плотной оболочкой).

Затем исследователи приступили к подготовке псевдобеременных самок-реципиентов, необходимых для вынашивания зигот. Обычно для этого самкам позволяют спариться с самцами, прошедшими вазэктомию, однако на сумчатых эту методику ранее не опробовали. Киёнари и его коллеги смогли экспериментальным путем доказать, что данный подход эффективен в отношении опоссумов: после совокуплений с вазэктомированными самцами самки, как обработанные гормонами, так и нет, демонстрировали признаки ложной беременности, включая набухание матки. А после того, как в матку псевдобеременной самки, которая не получала инъекций гормонов, ввели зиготы другой особи, она успешно выносила и родила семерых детенышей (две самки, получавшие инъекции гормонов, не смогли выносить потомство).

Закончив с предварительной подготовкой, Киёнари с соавторами приступили к этапу генного редактирования. Их целью было внедрить инструмент CRISPR/Cas9 в зиготу на пронуклеарной стадии и с его помощью вырезать из ДНК ген Tyr, кодирующий фермент тирозиназу. Данный ген часто служит мишенью при тестировании генетических технологий, поскольку его отсутствие приводит к альбинизму. Иными словами, по внешнему виду появившихся на свет детенышей легко понять, сработало ли редактирование. У опоссумов Tyr расположен на четвертой хромосоме и состоит из пяти экзонов. Исследователи создали две гидовые РНК, которая нацеливает генетические ножницы на четвертый из этих экзонов — его же ранее вырезали, чтобы отключить производство тирозиназы у мышей.

Исследователи собрали у оплодотворенных самок зиготы возрастом 34 часа, с помощью микроинъекционных игл с пьезоэлектрическим приводом проникли сквозь их оболочку и ввели в пронуклеусы или цитоплазму инструмент генного редактирования. Затем зиготы подсадили псевдобеременным самкам, не проходившим обработку гормонами. Использование одной гидовой РНК не позволило отключить ген Tyr, однако, когда ее дополнили второй, эксперимент привел к нужным результатам. Из девятнадцати родившихся детенышей у пятнадцати были отмечены признаки недостаточной выработки тирозиназы. Из них пять были альбиносами, двое отличались мозаичной окраской, а восемь обладали нормальной расцветкой, но несли отредактированные аллели гена Tyr. Когда ученые скрестили самца-альбиноса с мозаичной самкой, все девять их детенышей оказались белыми, то есть отредактированные аллели передались следующему поколению. Это указывает, что первое в мире редактирование генома сумчатых прошло успешно. Киёнари и его соавторы надеются, что их достижение поможет активнее использовать домовых опоссумов в качестве лабораторных животных, а также подстегнет исследования сумчатых млекопитающих. 

Около двух лет назад биологи впервые отредактировали геном рептилий. Ими стали коричневые анолисы (Anolis sagrei), которых с помощью CRISPR/Cas9 превратили в альбиносов. Изменения были внесены не в оплодотворенные, а в незрелые неоплодотворенные яйцеклетки.

Сергей Коленов

Источник: nplus1.ru

Adblock test .