Группа ученых из США под руководством Фэна Чжана, одного из пионеров CRISPR/Cas-редактирования (он первым показал работу системы в клетках людей), расширила спектр возможностей CRISPR/Cas, научив ее исправлять последовательности РНК. Несколько лет назад им удалось заставить систему атаковать адениновые нуклеотиды, теперь на очереди цитозиновые. Такое редактирование позволяет изменять активность уже не генов, а кодируемых ими белков.
Cas13 (розовый), ведомый гидом (красный), редактирует РНК в клетке (синяя)
© Stephen Dixon
Систему CRISPR/Cas обычно используют для редактирования генома, т. е. ДНК. Однако ее можно адаптировать и к редактированию РНК, взяв вместо «девятого» CRISPR-ассоциированного белка — Cas13, который связывается именно с РНК. В 2017 году группа Фэна Чжана разработала систему REPAIR (RNA editing for programmable A to I (G) re-placement) — это система CRISPR/Cas13, в которой к «беззубому» Cas13 (dCas13, инактивированный белок, который способен лишь узнать последовательность, но не разрезать ее) «пришит» домен ADAR2. Этот домен используют для редактирования азотистых оснований, то есть замены одной «буквы» в тексте нуклеиновой кислоты на другую. Система REPAIR специализировалась на превращении аденинового нуклеотида (А) в инозиновые (аналоги гуаниновых, Г), но была бессильна против других типов нуклеотидов.
Теперь группа Фэна Чжана взялась за редактирование цитозиновых нуклеотидов. Авторы работы получили необходимый белок дезаминазу из уже используемого ADAR2 путем контролируемого мутагенеза. Получившаяся в итоге дезаминаза содержала 16 мутаций и работала исключительно с двуцепочечной РНК. Так же, как и в системе REPAIR, ее прикрепили к dCas13. Новая система способна заменять цитозиновые нуклеотиды (Ц) на урациловые (У) и потому получила название RESCUE (RNA Editing for Specific C to UExchange).
Следующим шагом стала проверка эффективности системы на культуре человеческих клеток. Целями для редактирования стали места на РНК, изменение которых должно привести к активности белков: в зависимости от аминокислот, находящихся в определенных участках белковой молекулы, на белок с большей или меньшей вероятностью навешивается «черная метка», приводящая к его расщеплению. Поэтому, изменяя последовательность РНК, можно изменять аминокислотный состав и влиять на стабильность белка в клетке и, следовательно, на его активность. В этих экспериментах процент отредактированных РНК составил от 5% до 42%.
Полученный ADAR2 сохранил способность дезаминировать аденозин с образованием инозита, поэтому в определенных условиях система RESCUE может превращать и Г в Ц, и А в И, однако эффективность этого процесса невелика — 15% и 5% соответственно. Кроме того, встречается и нецелевое редактирование, которое частично удалось снизить, еще раз «поколдовав» над ADAR2 с помощью контролируемого мутагенеза.
RESCUE расширяет инструментарий молекулярных биологов, поскольку позволяет вносить обратимые изменения в работу клетки: не «ломать» геном целиком, а точечно влиять на активность отдельных его продуктов. Обратимость и недолговременность подобных правок делает новый инструмент Чжана привлекательным для экспериментов по манипуляции профилем экспрессии генома человека в медицинских целях.
Статья опубликована в журнале Science
Источник: chrdk.ru
