У атрибактерий из горячих источников есть внутренняя цитоплазматическая мембрана

За последние годы геномные методы позволили обнаружить большое количество новых таксонов микроорганизмов и вирусов. При этом изучение их биологии и строения происходит чрезвычайно медленно, в частности, потому что исследователи не знают, как их выделить и как культивировать в условиях лаборатории. Тип-кандидат Atribacteria обнаружили в горячих источниках Йеллоустона еще в 1998 году с помощью исследования метагеномов, но только сейчас японским ученым удалось вырастить культуру этих бактерий и изучить их строение. Оказалось, что атрибактерии имеют необычную многослойную структуру и большое количество генов, связанных с формированием и функционированием мембран. Одна из интерпретаций находки — эта многослойная структура является прообразом ядра. Возможно, атрибактерии немного приблизят ученых к пониманию того, как возникли ядерные организмы.

В 1998 году исследователи из Калифорнийского университета в Беркли описали бактериальное сообщество горячего источника Obsidian Pool (OP) в Йеллоустонском национальном парке (P. Hugenholz et al., 1998. Novel Division Level Bacterial Diversity in a Yellowstone Hot Spring). Ранее в этом источнике уже находили новые таксоны архей, но в ходе указанной работы было обнаружено аж 54 отдельные группы бактерий, 30% из которых не удалось связать с ранее описанными бактериальными типами. Самих бактерий никто не видел, новые группы выделяли с помощью исследования метагенома — генетического материала, выделенного из горячего источника классическим методом — определением последовательностей гена 16S рибосомальной РНК. Этот метод позволяет различать виды микроорганизмов в сложных микробных сообществах, например донных осадках или геотермальных источниках (подробнее об этой методике можно прочитать в статье Валерия Поройко Глубокоуважаемый микроб). Для этого не нужно выделять отдельные микроорганизмы, достаточно выделить «общую» ДНК всех организмов из исследуемого образца, собрать из нее коллекцию последовательностей 16S рРНК с помощью ПЦР и секвенировать их (определить эти последовательности). Далее последовательности сравнивают с уже известными из баз данных и по результатам сравнения определяют известные группы бактерий, выделяют неизвестные и находят их место в филогенетических деревьях.

Представителей одной из обнаруженных групп — OP9 (Obsidian Pool 9) — позднее находили в других геотермальных источниках, реакторах для получения биогаза, природных резервуарах углеводорода или других местах. Но все эти находки также были сделаны с помощью определения характерной последовательности 16S рРНК. Со временем секвенирование стало быстрее, дешевле и проще. Кроме того, стало возможным секвенировать не только ген 16S рРНК, но и геномы новых организмов целиком, причем для этого достаточно всего одной клетки. Именно этот подход использовали в 2013 году исследователи из США. Они выделили отдельные бактериальные клетки и клетки архей из осадка источника Литтл-Хот-Крик (Калифорния, США), и отсеквенировали их геномы (J. A. Dodsworth et al., 2013. Single-cell and metagenomic analyses indicate a fermentative and saccharolytic lifestyle for members of the OP9 lineage). В этих образцах вновь обнаружили клетки из группы OP9. Анализ их геномов и сравнение его с подобными бактериями в похожих микробных сообществах показал, что бактерии скорее всего грамположительные (хотя возможно у них была какая-то внешняя мембрана), используют геми- и целлюлозу для питания и выделяют углекислый газ и водород. Эти результаты позволили выделить OP9 в отдельный тип-кандидат Ca. Atribacteria (к кандидатным типам относят типы бактерий, которые хорошо охарактеризованы с помощью геномных исследований, но пока не культивированы в лаборатории). Ближе всего к атрибактериям тип бактерий Firmicutes, к которым относятся многие известные нам патогены и бактерии нормального микробиома человека (M. K. Nobu et al., 2015. Phylogeny and physiology of candidate phylum ‘Atribacteria’ (OP9/JS1) inferred from cultivation-independent genomics).

Но самих бактерий толком никто не видел, кроме тех самых отдельных клеток, геном которых ранее определяли исследователи. Это были палочковидные бактерии в среднем 4,5 мкм в длину и 0,5 мкм в ширину. Так они еще долго оставались частью так называемой «биологической темной материи» (biological dark matter). Этот термин появился в середине 2000-х, когда количество таксонов вновь выделенных с помощью молекулярного анализа микроорганизмов намного превысило количество физически выделенных и культивированных. По некоторым оценкам более половины уже выделенных типов бактерий не культивированы и не изучены в лабораторных условиях. Из-за этого мы мало что знаем о том, как эти бактерии выглядят и в чем особенности их биологии.

Культивирование новых микроорганизмов — непростая задача. Необходимо подобрать правильные условия: источник получения энергии, все необходимые для роста вещества, температуру. Наконец, некоторые бактерии растут только в присутствии других микроорганизмов. В мире существует несколько лабораторий, которые посвятили свои исследования этому вопросу. Одна из них — лаборатория Йоичи Камагаты (Yoichi Kamagata) из Национального института передовой промышленной науки и технологии в Цукубе (Япония). Эта лаборатория уже культивировала большое количество бактерий, которые до этого не были исследованы. В том числе она участвовала в выделении первого живого представителя асгардархей (Asgardarcheota), к которым, вероятно, относятся предки эукариот. Об этом открытии «Элементы» писали ранее (см. Обнаружен живой представитель аскардархей, «Элементы», 22.08.2019). Совместно с лабораторией Хидеюки Тамаки (Hideyuki Tamaki), которая также принимала участие в исследовании асгардархей, сделана попытка культивировать атрибактерии.

В течение трех лет исследователи помещали на различные типы сред образцы из воды и осадков подземных газовых месторождений, чтобы выделить штамм атрибактерий, которому дали предварительное название RT761. Бактерии этого штамма имели палочковидную или яйцевидную форму с заостренными кончиками. Они оказались грамотрицательными, что противоречило предыдущим предсказаниям, полученным с помощью биоинформатического анализа.

Далее, исследователи решили изучить бактерию с помощью криоэлектронной томографии и обнаружили в ней три слоя, похожие на типичные двухслойные липидные мембраны. Между наружным и внутренним мембраноподобными слоями находилось пространство шириной около 7 нм, в котором был еще один слой потоньше (рис. 2). Обычно у грамотрицательных бактерий присутствуют две липидные мембраны (наружная и цитоплазматическая). Поэтому из трех обнаруженных мембраноподобных слоев два, скорее всего, — это «истинные» липидные мембраны бактериальной клетки. Однако происхождение третьей «мембраны» стало загадкой. Кроме того, авторы не показали, что эти структуры действительно состоят из липидов, поэтому осторожно называют все три слоя мембраноподобными (lipid membrane-like layers).

Контур внутренней «мембраны» не полностью повторял контуры средней и наружной «мембран», образуя между собой и ними большие пространства на полюсах бактерий. Исследователи проанализировали бактериальные клетки с помощью просвечивающей электронной микроскопии и обнаружили, что внутренняя мембрана обволакивает нуклеоид бактерии. Такое строение до некоторой степени напоминает оболочку ядра, которая наблюдается у эукариот. Но как доказать, что это именно она, если точный состав всех трех мембран неизвестен? Помогло изучение генома и транскриптома RT761.

Во-первых, авторы нашли в геноме RT761 гены, кодирующие 34 белка с необычными N-концевыми последовательностями. Среди них были белки, критически важные для работы клетки: связанные с делением клетки (FtsZ), синтезом компонентов мембран (LpxC), репарацией и репликацией ДНК, регуляцией транскрипции и образованием водорода. Ранее такие последовательности находили только у белков, которые находятся в просвете бактериальных микрокомпартментов (см. bacterial microcompartment) — небольших участков цитоплазмы бактерий, ограниченных белковой оболочкой, в которых обычно происходят ферментативные реакции. Однако, такие микрокомпартменты не были обнаружены у атрибактерии. Авторы предполагают, что присутствие таких последовательностей способствует взаимодействию белков с мембранами, однако это пока остается только гипотезой.

Транскриптомный анализ показал, что во время активного деления RT761 производят большое количество мРНК, связанных с функцией мембран. Среди десяти наиболее экспрессированных белков встречаются трансмембранные белки, липопротеины, точные функции которых неизвестны. Однако их доля позволяет задуматься о важности мембран в жизни RT761. Другая интересная находка: генов, кодирующих белки с трансмембранными доменами (то есть доменами, позволяющими белку находиться в мембране и «торчать» по обе стороны от нее) у RT761 больше, чем у 99,7% всех грамотрицательных штаммов бактерий с известными геномами.

Культивирование RT761 подтвердило догадки ученых относительно питания атрибактерий. Атрибактерии, как и предполагалось ранее, оказались анаэробными, использовали глюкозу в качестве источника энергии, а в качестве конечных продуктов метаболизма выделяли ацетат, углекислый газ, следовые количества этанола и водород. При этом RT761 оказались довольно чувствительными к избытку водорода, что не очень характерно для бактерий, выделяющих его при метаболизме. Оказалось, что если выращивать RT761 с метаногенными археями, которым для метаболизма нужен водород, то RT761 растут практически идеально. Такую метаболическую созависимость называют синтрофией, и она наблюдается у других бактерий, выделяющих водород. В экспериментах с культурой RT761 в качестве партнера использовали археи Methanothermobacter thermophylus, которые так же, как и RT761, можно найти в геотермальных источниках. Однако пока неизвестно, как обстоят дела в реальных микробных сообществах, где можно встретить атрибактерий. Еще одна особенность: судя по результатам генного анализа, метаболизм сахаров у RT761 все же отличается от других бактерий. В частности, они не производят и не метаболизируют молочную кислоту, что характерно для водород-образующих бактерий. Кроме того, у RT761 нет распространенных ферментов, связанных с окислением молекулярного водорода.

По результатам обсуждаемого исследования ученые предлагают все же выделить атрибактерии в отдельный тип Atriobacterota, а штамму RT761 дать название Atribacter laminatus. Но несмотря на успехи в культивировании, вопрос о том, что это за мембраноподобные слои у A. laminatus и, особенно, что собой представляет внутренний слой, который по-видимому покрывает ее нуклеоид, остается открытым.

Безусловно, без культивирования присутствие многочисленных мембраноподобных слоев было бы сложно показать. Но интерпретировать эту находку следует осторожно. В статье-комментарии, опубликованной в журнале Nature Communications после выхода обсуждаемой работы, предлагается несколько вариантов интерпретации (рис. 3).

В первом варианте (см. центральную панель на рис. 3) представлено объяснение авторов обсуждаемой статьи. Снаружи клетки находится наружная мембрана, под ней — цитоплазматическая мембрана, а внутренняя цитоплазматическая мембрана отгораживает большое пространство клетки, в котором расположен нуклеоид. Интересно, что авторы наблюдают в этом «ядре» рибосомы, что совсем не характерно для эукариотических ядер. Косвенным свидетельством того, что слои, которые нашли в атрибактериях, — это все же липидные мембраны, стал анализ генома A. laminatus, в котором обнаружено большое количество генов, связанных с метаболизмом мембран. Но чтобы установить истину, требуются прямые эксперименты, которые покажут состав и строение мембраноподобных слоев.

Например, в наружной мембране грамотрицательных бактерий присутствуют белки порины и специфические липополисахариды, а в цитоплазматической мембране — белки, участвующие в синтезе АТФ. Кроме того, раз A. laminatus — грамотрицательная бактерия, то следует определить, где находится клеточная стенка, которая у грамотрицательных бактерий находится между внутренней и наружной мембраной. К сожалению, этих данных у нас пока нет.

Альтернативный сценарий, который смог бы объяснить наблюдаемую картину — никакой внутренней цитоплазматической мембраны нет, вместо нее мы наблюдаем обычную цитоплазматическую мембрану грамотрицательной бактерии. Снаружи от нее находится большое периплазматическое пространство из различных белков и полисахаридов, далее — наружная мембрана, а за ней — так называемый S-слой, состоящий из белков. Впрочем, авторы, описавшие A. laminatus, рассматривают и такой сценарий.

Почему же стоит предупредить об осторожной интерпретации результатов? Дело в том, что микробиологи уже один раз обожглись на другой бактерии, которая, как поначалу казалось, имеет ядро. Изначально бактерии Planctomycetes были определены как некий эукариотический организм, похожий на грибы. Это было в 1924 году. В 1972 году все же было подтверждено, что это бактерии, в 1984 году — что это не археи. С царством вроде определились. Однако структура клетки планктомицетов во многом отличалась от типичной структуры грамотрицательной бактериальной клетки. Долгое время предполагалось, что у планктомицетов отсутствует характерная для бактерий клеточная стенка из пептидогликанов. У них наблюдалась внутренняя цитоплазматическая мембрана. Были и другие особенности, но самой выдающейся было наличие у некоторых планктомицетов структуры, очень похожей на ядро (рис. 4).

Однако, после более тщательного изучения оказалось, что все, возможно, совсем не так (см. C. Boedeker et al., 2017. Determining the bacterial cell biology of Planctomycetes и обзор S. Wiegand et al., 2018. On the maverick Planctomycetes).

Клеточная стенка из пептидогликанов была обнаружена с помощью биоинформатического анализа. Он показал наличие всех генов, необходимых для синтеза пептидогликанов. Далее последовал биохимический анализ, с помощью которого у планктомицетов нашли аминосахара N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовую кислоту и другие компоненты клеточной стенки бактерий. Наконец, клеточная стенка планктомицетоы разрушалась лизоцимом — типичным ферментом, разрушающим пептидогликаны.

Предполагалось, что внутренняя цитоплазматическая мембрана делит цитоплазму планктомицетов на два пространства: перифоплазму и пиреллюлосому. Перифоплазма находится между цитоплазматической и внутренней клеточной мембраной и не содержит рибосом. В пиреллюлосоме находятся рибосомы и нуклеоид. Описание очень похоже на тот сценарий, который предлагают для атрибактерий (сравните сценарий 1 и сценарий 3, указанные на рис. 3). Однако, исследования с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения и криоэлектронной томографии показали, что в действительности бактерии имеют необычно большое периплазматическое пространство, которое образует многочисленные вогнутые участки, а от цитоплазмы его отделяет цитоплазматическая мембрана. К сожалению, другие признаки близости планктомицетов к эукариотическим организмам, такие как эндоцитоз, тоже не подтвердились.

Тем не менее, исследователи, выделившие A. laminatus, осторожны в интерпретации своих наблюдений, и наверняка уже готовят новые публикации, раскрывающие секреты атрибактерий.

Источники:
1) Taiki Katayama, Masaru K. Nobu, Hiroyuki Kusada, Xian-Ying Meng, Naoki Hosogi, Katsuyuki Uematsu, Hideyoshi Yoshioka, Yoichi Kamagata & Hideyuki Tamaki. Isolation of a member of the candidate phylum ‘Atribacteria’ reveals a unique cell membrane structure // Nature Communications. 2020. DOI: 10.1038/s41467-020-20149-5.
2) Muriel C. F. van Teeseling & Christian Jogler. Cultivation of elusive microbes unearthed exciting biology // Nature Communications. 2020. DOI: 10.1038/s41467-020-20393-9.

Екатерина Грачева

Источник: elementy.ru

. .